Austrių grybų lakazės NRC 620 gamyba ir biocheminė charakteristika bei jos efektyvumo obuolių sulčių skaidrinime įvertinimas.

Po 25 dienų statinės inkubacijos 28 °C temperatūroje, *Pleurotus ostreatus* NRC620 lakazė grybų kultūros terpėje pasižymėjo didžiausiu aktyvumu. Optimalios šio fermento pH ir temperatūros vertės buvo atitinkamai 3,0 ir 70 °C. Po 2 valandų inkubacijos 40 °C ir 50 °C temperatūroje fermento aktyvumas išliko atitinkamai 68,33 % ir 59,61 %. Po 2 valandų inkubacijos citrato-fosfato buferyje (pH 7,0) fermento aktyvumas išliko 100 %. 10 mM MgSO₄ ir CuSO₄ pridėjimas padidino fermento aktyvumą atitinkamai maždaug 21 % ir 35 %, o NaCl, MnCl₂, KCl ir CaCl₂ slopino fermento aktyvumą. Naudojant ABTS kaip substratą, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakazės kinetiniai parametrai (Km ir Vmax) buvo atitinkamai 1,99 mM ir 16 217 μmol min−1 L−1. Fermentinis obuolių sulčių mėginių apdorojimas reikšmingai sumažino ir pH, ir klampumą, ir šis sumažėjimas koreliavo su laikymo laiko padidėjimu. Lakazės apdorojimas šiek tiek sumažino bendrą fenolių kiekį obuolių sultyse, tačiau antioksidacinio aktyvumo sumažėjimo nepastebėta.
Pastaraisiais metais tyrėjai daugiausia dėmesio skyrė žaliosios biotechnologijos taikymui maisto pramonėje. Lakazė yra vienas naudingiausių fermentų maisto pramonėje, naudojamas tokiose srityse kaip sulčių gamyba, kepimas, vyno stabilizavimas ir maisto produktų organoleptinių savybių gerinimas.¹Daugelis aukštesniųjų augalų ir mikroorganizmų išskiria lakazę,²ir tokie grybai kaip deuteromicetai, askomicetai ir bazidiomicetai taip pat gali gaminti lakazę.³Lakazė (EC 1.10.3.2) yra mėlynoji oksidazė, kuri redukuoja molekulinį deguonį į vandenį, naudodama sistemą, sudarytą iš trijų skirtingų vario atomų, tokiu būdu oksiduodama įvairius fenolio junginius ir aromatinius aminus. Gaminant vaisių ir daržovių sultis, fermentinis ir nefermentinis rudėjimas yra labai svarbūs.⁴Kadangi šios medžiagos neigiamai veikia sulčių spalvą, skonį ir aromatą, jas reikia pašalinti.⁵
Iš visų vaisių obuoliai yra labiausiai suvartojami visame pasaulyje ir Europos Sąjungoje. 2019 m. obuolių derlius užėmė trečią vietą pasaulyje, viršydamas 87 mln. tonų.⁶Obuoliuose yra daug fenolinių junginių, įskaitant flavonoidus ir fenolines rūgštis, tokias kaip kofeino rūgštis ir chlorogeno rūgštis.⁷Kadangi obuolių sultys paprastai geriamos skaidrios, filtravimo proceso metu prarandama maždaug 50–90 % fenolinių komponentų.⁸Šiandien vartotojai linkę rinktis minimaliai perdirbtus produktus, pavyzdžiui, drumstas obuolių sultis su dideliu polifenolių kiekiu. Tačiau dėl didelio fenolių kiekio šios rūšies obuolių sultys yra ypač jautrios spalvos pakitimui ir patamsėjimui.⁹Obuolių sulčių patamsėjimui sumažinti arba išvengti naudojamos įvairios technologijos, įskaitant terminio apdorojimo metodus, tokius kaip pasterizavimas 60–90 °C temperatūroje.¹⁰Tačiau, remiantis Saucedos-Gálvezo tyrimais¹¹Terminis apdorojimas gali sunaikinti lakias chemines medžiagas ir paveikti obuolių sulčių organoleptines savybes. Terminio apdorojimo metodų alternatyvos yra superkritinis anglies dioksidas, ultravioletinė spinduliuotė, ultragarsas, aukštas hidrostatinis slėgis arba aukšto slėgio homogenizavimas.¹²Šių technologijų efektyvumas ir tinkamų vaisių sulčių išeiga priklauso nuo naudojamų parametrų ir produkto savybių. Jų platų naudojimą riboja didelės išlaidos, neigiamas poveikis kai kurių maisto produktų kokybei arba nepakankamas fermentų inaktyvavimas.^13,14
Lakazė gali būti naudojama vaisių sultims stabilizuoti ir skaidrinti.¹⁵Gökmen ir kt.¹⁶rekomenduoja vaisių sultims skaidrinti naudoti lakazę, nes ji efektyviai pašalina fenolio junginius, paversdama juos polimerais arba oligomerais, kuriuos lengvai pašalina bet kokia ultrafiltracijos membrana, leisdama obuolių sultims išlaikyti stabilią spalvą ir skaidrumą iki šešių savaičių 50 °C temperatūroje. Išgryninta *Trichoderma* lakazė buvo imobilizuota ant aliuminio oksido granulių ir naudojama selektyviai pašalinti nemalonaus skonio junginius, kuriuos sukelia obuolių sulčių mikrobinė tarša.¹⁷
Maždaug 80–90 % lakiųjų obuolių sulčių komponentų yra esteriai ir aldehidai, kurie suteikia sultims unikalų aromatą.¹⁸Obuolių sulčių skaidrinimui ant nebrangios atramos, pagamintos iš natūralaus jaunų kokosų kevalų pluošto, buvo imobilizuota *Trametes versicolor* lakazė.¹⁹Ankstesniuose tyrimuose buvo tiriamas obuolių sulčių stabilizavimas (spalva ir drumstumas) naudojant metodus be fermentų arba imobilizuojant, arba kartu su ultrafiltracija.^5,19Vis dėlto grybinių lakazių poveikis obuolių sulčių fizikinėms ir cheminėms savybėms laikymo metu lieka neaiškus. Todėl šio tyrimo tikslas buvo eksperimentiškai ištirti obuolių sulčių fizikinių ir cheminių savybių, fenolio junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo pokyčius po apdorojimo grybinėmis lakazėmis ir dviejų savaičių laikymo šaldytuve. Lakazės geba oksiduoti fenolio junginius, todėl jas perspektyvu naudoti įvairiuose pramoniniuose procesuose, įskaitant sulčių skaidrinimą. Šiame tyrime buvo tiriamos lakazės iš *Pleurotus ostreatus* NRC 620, daugiausia dėmesio skiriant idealioms jų aktyvumo ir efektyvumo sulčių skaidrinimo metu sąlygoms. Nors austrių grybų (P. ostreatus NRC 620) tyrimų vis dar yra nedaug, ankstesniuose tyrimuose buvo tiriami fermentai iš įvairių grybų, tokių kaip Trametes versicolor ir Ganoderma lucidum. Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti šio fermento pritaikymą maisto pramonėje ir pabrėžti jo unikalias savybes, ypač idealų pH ir temperatūrą.
2,2′-azooksibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonrūgštis) (ABTS) buvo įsigyta iš „Sigma-Aldrich“ (Kanada). Visi kiti reagentai buvo analitinės kokybės.
Nacionalinio tyrimų centro Mikrobinių kultūrų kolekcijos centras įsigijo žinomą austrių grybų padermę NRC620. Po subkultūros ši padermė buvo laikoma bulvių dekstrozės agaro nuožulniuosiuose sluoksniuose 4 °C temperatūroje. Inokuliato paruošimo metodas buvo toks: 10 dienų senumo, visiškai išsivysčiusi grybiena buvo inokuliuojama ant bulvių dekstrozės agaro lėkštelių ir inkubuojama 28 °C temperatūroje. Po 10 dienų trys 12 mm skersmens grybienos blokai buvo išimti iš agaro terpės steriliu metaliniu perforatoriumi ir sudėti į 250 ml Erlenmejerio kolbas su vatos kamšteliais, kuriuose buvo 50 ml sterilizuotos kultūros terpės (pH 5,0, kaip anksčiau aprašė Othman ir kt.).²⁰Kultūros buvo inkubuojamos 28 °C temperatūroje 18 dienų. Tada kultūros buvo filtruojamos per „Whatman No. 1“ filtro popierių, o gautas supernatantas buvo naudojamas kaip fermento šaltinis.
Lakazės aktyvumas buvo nustatytas naudojant ABTS kaip substratą. Reakcijos mišinyje (2 ml) buvo 500 μl 0,3 mM ABTS (ištirpinto 0,1 M natrio citrato buferyje, pH 4,5) ir reikiamas fermento mėginio kiekis, praskiestas distiliuotu vandeniu.^21,22Atsižvelgiant į tai, kad lakazė gali oksiduoti ABTS kambario temperatūroje (28 °C ± 2), ABTS oksidacija buvo nustatyta matuojant absorbcijos padidėjimą esant 420 nm bangos ilgiui (ε₄₂₀= 36 000 cm³^-1 M ^-1) naudojant „Agilent Carry-100“ UV spektrofotometrą. Vienas lakazės aktyvumo vienetas buvo reikalingas 1 μmol ABTS oksidacijai per minutę. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bradfordo metodu, naudojant galvijų serumo albuminą kaip vidinę kontrolę.^23,24
Gavus fermentą iš austrių grybų padermės NRC 620, jo aktyvumas buvo matuojamas skirtingais auginimo intervalais 25 dienas statinėmis sąlygomis 28 °C temperatūroje.
Norint ištirti temperatūros įtaką lakazės aktyvumui, eksperimentai buvo atlikti 20–90 °C temperatūros intervale. Prieš pridedant fermentą ir pradedant reakciją, buferis (0,1 M natrio citratas, pH 4,5) ir substratas (ABTS) buvo sumaišyti ir inkubuoti 5 minutes skirtingose ​​temperatūrose. Fermento terminis stabilumas buvo įvertintas inkubuojant 0,05 M natrio fosfato buferyje (pH 7,0) atitinkamai 40, 50, 60 ir 70 °C temperatūroje 2 valandas. Likęs aktyvumas buvo įvertintas naudojant ABTS substratą.
pH poveikis lakazės aktyvumui buvo įvertintas naudojant ABTS kaip substratą 0,1 M citrato-fosfato buferiuose, kurių pH intervalas buvo nuo 2,5 iki 7,0. Fermento tirpalas buvo inkubuojamas 40 °C temperatūroje dvi valandas 0,1 M citrato ir Tris buferiuose (pH 3, 4, 6 ir 7), siekiant įvertinti pH stabilumą. Liekamasis aktyvumas su ABTS kaip substratu buvo apskaičiuotas po inkubacijos.
Lakazė 10 min. buvo inkubuojama natrio fosfato buferyje (0,05 M, pH 7,0), kuriame yra įvairių metalų jonų (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ ir Mn2+), kurių koncentracijos buvo atitinkamai 2,5 mM ir 10 mM. Tada buvo pridėtas substratas (ABTS), kad būtų pradėta reakcija, ir įvertintas santykinis aktyvumas.
ABTS oksidacija lakaze esant įvairioms koncentracijoms (0,025–3 mM) buvo matuojama esant pH 4,5, siekiant nustatyti kinetinius parametrus (Vmax ir Km).^konstantosMichaelio-Menteno lygties kintamieji buvo apskaičiuoti naudojant Lineweaver-Burko grafiką, kuris nubraižo reakcijos greičio atvirkštinę vertę kaip substrato koncentracijos funkciją. Kinetinės konstantos buvo apskaičiuotos iš Lineweaver-Burko grafiko naudojant „GraphPad Prism“ 6.01 versijos programinę įrangą.
Kruopščiai nuplovus obuolius vandeniu iš čiaupo, jie buvo perpjauti per pusę ir išspaustos sultys naudojant automatinę „Braun MP80“ obuolių sulčiaspaudę (pagamintą Vokietijoje). Sultys buvo filtruojamos per keturis marlės sluoksnius. Kontrolinei grupei nebuvo pridėta jokių fermentų, o į šviežiai paruoštas obuolių sultis buvo įdėta 2,0 % lakazės (efektyviausia išbandyta koncentracija), kurios vėliau dvi savaites buvo laikomos 4 °C temperatūroje.
Titruojamasis rūgštingumas (TA) ir pH buvo nustatyti pagal Boulton ir kt. metodą.^{27. al.}Kiekvieno mėginio pH buvo matuojamas skaitmeniniu pH matuokliu (JENWAY 3510 pH matuoklis). Titruojamas rūgštingumas (TA) buvo apskaičiuotas pagal obuolių rūgštį pagal šią formulę.
Kur V ir C yra atitinkamai titravimui naudoto natrio hidroksido tirpalo tūris (ml) ir koncentracija (0,1 mol/l). K yra obuolių rūgšties konversijos koeficientas, lygus 0,067, o W yra obuolių sulčių masė (g).
Bendras tirpių kietųjų dalelių kiekis (^TDS) visų sulčių mėginių kiekis buvo nustatytas naudojant PAL-1 kišeninį refraktometrą (ATAGO, Tokijas, Japonija). Po kiekvieno matavimo optinis lęšis buvo praplautas dejonizuotu vandeniu, o kiekvienas obuolių sulčių mėginys buvo išbandytas tris kartus. Kiekvieno mėginio vertė buvo apskaičiuota apskaičiuojant trijų matavimų vidurkį. Kiekvieno obuolių sulčių mėginio vidurkis ± standartinis nuokrypis taip pat buvo apskaičiuotas apskaičiuojant šių rezultatų vidurkį.
Obuolių sulčių mėginių klampumas buvo įvertintas naudojant rotacinį viskozimetrą (RV, „Rheotest 2“, Vokietija). Mėginys buvo patalpintas viskozimetro „S2“ cilindre. Matomoji klampa buvo pavaizduota šlyties įtempio ir šlyties greičio kreivės nuolydžiu, kuris buvo apskaičiuotas pagal šlyties įtempį ir atitinkamas kreives esant įvairiems šlyties greičiams (nuo 1,00 iki 437,4 s⁻¹). Matomosios klampos apskaičiavimo formulė yra tokia:
Kur η yra tariamoji klampa (cP), τ yra šlyties įtempis (dyn/cm²), γ yra šlyties greitis (sec⁻¹), o (τ) apskaičiuojamas naudojant sukimo momento (α) ir cilindro (Z) vertes pagal šią formulę: τ = Z . α.
Rudumo indeksas buvo nustatytas pagal Meidav ​​ir kt. metodą.^al.2910 ml sulčių mėginys buvo centrifuguojamas 2750 x g greičiu 10 min. 5 ml sulčių supernatanto buvo sumaišytas su 5 ml 95 % etanolio. Mišinio absorbcija buvo matuojama esant 420 nm bangos ilgiui, naudojant „Shimadzu“ UV spektrofotometrą (UV-1601 PC).
Bendras fenolių kiekis (TPC) buvo nustatytas kolorimetriškai, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą, kaip aprašė Boulton ir kt.^[27]]. Buvo sudaryta galio rūgšties standartinė kreivė, kai koncentracijos yra nuo 0 iki 500 mg/l (^r²= 0,997). Rezultatai išreiškiami galio rūgšties ekvivalentais (mg GAE/ml).
Į 25 μl obuolių sulčių įpilkite 125 μl distiliuoto vandens ir 2850 μl FRAP tirpalo ir palikite mišinį tamsoje.³⁰min. Tada išmatuokite absorbciją esant 593 nm bangos ilgiui, naudodami „Shimadzu UV“ spektrofotometrą (UV-1601 PC). FRAP reagentas buvo paruoštas sumaišant 300 mM acetato buferį (pH 3,6), 20 mM geležies(III) chloridą ir 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triaziną (TPTZ) (ištirpintą 40 mM HCl) santykiu 10:1:1. Standartinė kreivė buvo sudaryta naudojant „Trolox“ kaip standartą (^R²= 0,999), o rezultatai išreiškiami μM Trolox/ml.
Apdorotų ir neapdorotų sulčių antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant DPPH metodą, siekiant įvertinti jų gebėjimą surišti DPPH laisvuosius radikalus.³¹Dešimt mikrolitrų sulčių buvo sumaišyta su 1 ml DPPH tirpalo (100 μM) metanolyje. Po 30 min. reakcijos tamsoje mišinio absorbcija buvo matuojama esant 517 nm bangos ilgiui, naudojant „Shimadzu“ UV spektrofotometrą (UV-1601 PC). Rezultatai buvo išreikšti trolokso ekvivalentais (μM trolokso/ml), remiantis kalibravimo kreive (_^R2= 0,990).
Gauti duomenys parodė, kad maksimali lakazės gamyba NRC 620 austrių grybuose buvo pastebėta 18-ąją fermentacijos dieną, pasiekus 1302 U/l aktyvumą. Tai buvo pagrindas nustatyti optimalų lakazės gamybos laiką (1 pav.). Nors fermentų gamyba didėjo ilgėjant auginimo laikui, augimo tempas nebuvo tiesiogiai proporcingas auginimo laikui; po 21 dienos fermentų aktyvumas padidėjo tik 90 U/l (iki 1390 U/l). Todėl galiausiai 18 dienų buvo pasirinktas kaip optimalus auginimo laikas, siekiant subalansuoti produkto išeigą ir ekonominę naudą, gaunamą dėl ilgesnio auginimo laiko.
Auginimo laiko įtaka lakazės derliui Pleurotus ostreatus NRC 620 veislėje. Trys (12 mm) grybienos micelio blokai buvo inokuliuoti į 50 ml sterilios terpės ir po to kultivuojami 28 °C temperatūroje skirtingą laiką.
Remiantis kitais tyrimais, mūsų rezultatai rodo, kad idealus kultivavimo laikotarpis, per kurį grybai pasiekia didžiausią lakazės sekreciją, greičiausiai yra nuo 7 iki 36 dienų.³²Pasak Ezike ir kt.³³*Trametes polyzona* WRF03 bakterijos devintąją fermentacijos dieną pagamino didžiausią lakazės kiekį, kurios specifinis aktyvumas siekė 1637 U/mg baltymo. Be to, Othman ir kt.³⁴Nustatyta, kad *Trichoderma harzianum* S7113 penktąją kultivavimo dieną išskyrė didelį kiekį lakazės. Lakazės gamybos greitis pasiekė didžiausią aktyvumą keturioliktąją dieną ir po to palaipsniui mažėjo.³⁴Nors fermentų sekrecija gali vykti ir pagrindinės augimo fazės metu, ji paprastai pasiekia piką tarpinėje fazėje ir ją sukelia anglies arba azoto šaltinio sunaudojimas.^34,35
Nors lakazė iš Pleurotus ostreatus NRC 620 pasižymėjo dideliu aktyvumu plačiame temperatūrų diapazone nuo 50 °C iki 80 °C, artėjant prie didžiausio aktyvumo (69–98 %), jos didžiausias aktyvumas buvo stebimas esant 70 °C temperatūrai (2a pav.). Už šio temperatūros diapazono ribų fermento aktyvumas sumažėjo maždaug ties 70 °C. Šie rezultatai rodo, kad fermentas yra aktyvus aukštoje temperatūroje, greičiausiai dėl to, kad aukšta temperatūra padidina reakcijos kinetinę energiją.
Reakcijos temperatūros (a) ir pH (b) įtaka lakazės aktyvumui *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperatūra nuo 20 iki 90 °C buvo pasiekta mišinį iš anksto inkubuojant skirtingose ​​temperatūrose 5 minutes prieš pridedant fermentą ir pradedant reakciją. pH poveikis lakazės aktyvumui buvo įvertintas naudojant ABTS kaip substratą tirpaluose, kuriuose buvo 0,1 M citrato-fosfato buferis, esant pH intervalui nuo 2,5 iki 7,0.
Pasak Ezike ir kt.^al.33Optimali *Trametes polyzona* WRF03 lakazės temperatūra yra 55 °C, tokia pati kaip ir *Ganoderma lucidum*.^lakazė36ir panaši į optimalią temperatūrą (50 °C) *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakazė . ^Baldrian38pažymi, kad, kaip ir kitoms ligniną skaidančioms fermentų sistemoms, idealus temperatūros diapazonas lakazei yra nuo 50 iki 70 °C.
Rezultatai parodė, kad fermentas pasižymėjo didžiausiu aktyvumu esant pH 3,0, pasiekdamas 94 % aktyvumą esant pH 3,5. Tačiau jis išliko aktyvus plačiame pH diapazone nuo 2,5 iki 7,0 (2b pav.). Be to, jis pasižymėjo didesniu aktyvumu rūgštinėje aplinkoje, palyginti su neutraliomis ar šarminėmis sąlygomis. Jo aktyvumas išliko mažiausiai 77 % esant pH diapazone nuo 2,5 iki 4,5, tačiau pasiekė tik maždaug 38 % esant pH 7,0. Optimalus *Trametes polyzona* WRF03 lakazės pH buvo 4,533, kuris yra toks pat kaip *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 ir *Trametes hirsuta* 41 lakazių pH. Tačiau, remiantis Chairin ir kt. tyrimu...⁴², optimalus pH lakazei iš *Polymorpha f. sp.* WR710-1 yra 2,2, o optimalus pH lakazei iš *Polymorpha f. sp.* IBL-04 yra 5,043. Hidroksido anijonų (lakazės inhibitoriaus) prisijungimas prie T2/T3 lakazės vario atomų gali būti sumažėjusio lakazės aktyvumo priežastis neutralioje arba šarminėje pH sąlygomis. Tai gali sutrikdyti vidinį elektronų perdavimą iš T1 centro į T2/T3 centrą, taip^ribojantisfermento aktyvumas23,44
Inkubuojant fermentą skirtingose ​​temperatūrose, nustatyta, kad tiek inkubacijos laikas, tiek temperatūra turėjo įtakos fermento stabilumui. Pažymėtina, kad *Trametes polyzona* NRC 620 lakazė pasižymėjo didesniu stabilumu 40 ℃ ir 50 ℃ temperatūroje, po 120 minučių išlaikydama atitinkamai 68,33 % ir 59,61 % pradinio aktyvumo (3a pav.). Priešingai, tomis pačiomis sąlygomis (40 ℃ ir 50 ℃, 120 minučių) *Trametes polyzona* WRF03 lakazė išlaikė atitinkamai 64,38 % ir 42,92 % savo aktyvumo.³³Priešingai, ilgėjant inkubacijos laikui ir temperatūrai, sumažėjo *Trametes polyzona* NRC 620 lakazės stabilumas; po 60 minučių inkubacijos 60 ℃ ir 70 ℃ temperatūroje jos aktyvumas sumažėjo atitinkamai iki 39,24 % ir 1,72 % (3a pav.). Atitinka eksperimentinius rezultatus, *Trametes polyzona* WRF03 lakazė pasižymėjo didesniu stabilumu 40 ir 50 ℃ temperatūroje viso terminio apdorojimo proceso metu.³³Panašiai ir Lueangjaroenkit ir kt.^al.37ir Chairin ir kt.^al.42pranešė apie lakazių iš Trametes polyzona KURNW027 ir Trametes polyzona WR710-1 stabilumą atitinkamai 50 °C temperatūroje 1 valandą. Kaip naudingas biokatalizatorius, taikomas įvairiose biotechnologijų srityse, lakazė turėtų pasižymėti geru stabilumu ir savybėmis plačiame temperatūrų diapazone.
Lakazės iš *Pleurotus ostreatus* NRC 620 termostatinis stabilumas (a) ir pH stabilumas (b). Termostatinis stabilumas buvo įvertintas inkubuojant fermento tirpalą 0,05 M natrio fosfato buferyje (pH 7,0) atitinkamai 40, 50, 60 ir 70 °C temperatūroje 2 valandas. pH stabilumas buvo įvertintas inkubuojant fermento tirpalą 0,1 M citrato buferyje ir Tris buferyje (pH 3, 4, 6 ir 7) 40 °C temperatūroje 2 valandas. Liekamasis aktyvumas buvo apskaičiuotas naudojant ABTS kaip substratą po inkubacijos.
Siekdami nustatyti optimalias fermentų naudojimo ir laikymo sąlygas, tyrėme pH įtaką lakazės stabilumui. Skirtingos pH vertės reikšmingai paveikė baltymo struktūros stabilumą, taip paveikdamos fermento molekulės stabilumą ir aktyvumą. Rezultatai parodė, kad fermentas buvo mažiau stabilus rūgštinėje aplinkoje, o geresnis stabilumas – esant aukštesnėms pH vertėms (neutralioje ir šarminėje aplinkoje). Esant 7,0, 6,0, 4,0 ir 3,0 pH vertėms, fermento sulaikymo greitis po 120 minučių buvo atitinkamai maždaug 100 %, 62,54 %, 52,39 % ir 11,14 % (3b pav.). *Strombus multisus* WRF03 lakazė pasižymėjo didesniu stabilumu esant neutralioms pH vertėms (5,5–6,5) ir mažesniu stabilumu – esant rūgštinėms pH vertėms (žemiau 4,0). Po 120 minučių, kai pH vertės buvo 5,5, 6,0 ir 6,5, fermentų sulaikymo rodikliai buvo atitinkamai maždaug 82 %, 100 % ir 93 %.³³Khairin ir kt.⁴²pažymėjo, kad iš Trametes polyzona WR710-1 gauta lakazė buvo stabili pH intervale nuo 6,0 iki 7,0, o Sayed ir kt.⁴⁵parodė, kad lakazė buvo stabilesnė neutraliomis pH sąlygomis. Tačiau iš *Cerrena unicolor* gauta lakazė taip pat pasižymėjo stabilumu šarminėse sąlygose (pH 9,0).⁴⁶Tirtos lakazės pasižymėjo dideliu stabilumu plačiame pH diapazone. Tai gali būti svarbi savybė pramoniniam pritaikymui.
Kadangi kai kurie metalų jonai turi ir stimuliuojantį, ir slopinantį poveikį fermentų aktyvumui, pramoniniuose taikymuose reikia atsižvelgti į jų poveikį fermentų aktyvumui. Tai labai svarbu, nes metalų jonai yra dažni aplinkos teršalai, galintys paveikti tarpląstelinių fermentų stabilumą ir sintezę.⁴⁷Norėdami ištirti kelių metalo jonų poveikį lakazei iš *Pleurotus ostreatus* NRC 620, atlikome atitinkamus eksperimentus. Kaip parodyta 4 paveiksle, priklausomai nuo naudojamo metalo tipo, metalo jonų koncentracijos padidinimas nuo 2,5 mM iki 10 mM neigiamai paveikė fermento funkciją. Pavyzdžiui,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺ir^Cu²⁺gali stimuliuoti ir aktyvuoti fermentų aktyvumą, tuo pačiu metu^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺ir^K⁺galėjo slopinti fermento aktyvumą. Esant 10 mM koncentracijai, Cu²⁺ ir Mg²⁺ jonai buvo stipriausi *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakazės aktyvumo aktyvatoriai, atitinkamai užtikrindami maždaug 34 % ir 20 % aktyvacijos laipsnį. Tačiau esant 10 mM koncentracijai, Ca²⁺ jonai buvo stipriausias lakazės inhibitorius, sumažindami fermento aktyvumą maždaug 60 %.
Metalo jonų poveikis Pleurotus ostreatus NRC 620 lakazės aktyvumui. Lakazė 10 minučių buvo inkubuojama natrio fosfato buferyje (0,05 M, pH 7,0), kuriame buvo įvairių metalų jonų, kurių koncentracijos buvo 2,5 mM ir 10 mM. Reakcija buvo inicijuota pridedant substrato (ABTS), po to buvo išmatuotas santykinis aktyvumas.
Mūsų rezultatai atitinka kitų autorių, kurie nustatė, kad Mg²⁺ ir Cu²⁺ sustiprina *Trametes polyzona* WRF03³ aktyvumą, rezultatus. Castaño ir kt.⁴⁸ nustatė, kad *Xylaria* sp. lakazę tam tikru mastu stimuliuoja vario jonai (Cu²⁺). Be to, Foroutanfar ir kt.⁴⁹ ir Si ir kt.⁵⁰ atliko panašius tyrimus su lakazėmis iš *Paraconiothyrium variabile* ir *Trametes pubescens*. Šio fermento II tipo vario prisijungimo vieta (T2) gali būti prisotinta Cu²⁺ esant tam tikrai koncentracijai, o tai gali paaiškinti lakazės aktyvumo stimuliavimą esant didesnėms Cu²⁺³⁹ koncentracijoms. Kadangi baltojo puvinio grybų lakazės yra oksidazės, turinčios daug vario atomų, variolio jonų poveikis lakazės aktyvumui yra įvairus ir svyruoja nuo stimuliuojančio ir slopinančio iki neutralaus.⁵¹ Priešingai, Zhou ir kt.^[52]pranešė, kad^Cu²⁺slopino Taivano požeminio termito (Odontotermes formosanus) lakazės aktyvumą. Tačiau Cerena sp. HYB07 lakazės^[53]ir Clitocybe maxima^[54]nebuvo paveikti vario jonų.
Substrato specifiškumas buvo parodytas jo kinetiniais parametrais (Km ir Vmax); kuo stipresnis substrato prisijungimo prie fermento afinitetas, tuo mažesnė Km vertė ir tuo didesnis substrato specifiškumas.^{3, 21, 55}Lakazės iš *Pleurotus ostreatus* NRC 620 kinetiniai parametrai (Km ir Vmax) buvo nustatyti naudojant „GraphPad Prism 6.0“ programinę įrangą, braižant „Lineweaver-Burk“ grafiką (5 pav.). Naudojant ABTS kaip substratą, rezultatai buvo 1,99 mM ir 16217 μmol.^{min.⁻¹ L⁻¹,}atitinkamai. Elsayed ir kt.²¹pranešė, kad ABTS oksidacijos Km vertės buvo atitinkamai 0,1 mM ir 0,064 mM, o tai rodo didelį Lac A ir Lac B izofermentų afinitetą ABTS. Be to, Vmax vertės buvo 0,182 μmol.^min.⁻¹ir 0,603 μmol^min.⁻¹atitinkamai. Gauta Km vertė buvo mažesnė nei Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); be to, jų Vmax vertė (1429 mmol min⁻¹) taip pat buvo^apatinisnaudojant ABTS kaip substratą.33 Panašiai, Lentinus squarrosulus MR13 ir Trametes sp. AH28-2 lakazės koncentracijos Km vertės buvo atitinkamai 0,0714 mM ir 0,025 mM, o Vmax vertės buvo 0,0091 mM min−1 ir 0,67 mM min−1 mg−1 (palyginti su ABTS).^{, atitinkamai.56,57}
Buvo tirtas ABTS koncentracijos poveikis lakazės iš *Pleurotus ostreatus* NRC 620 aktyvumui ir nubraižytas Lineweaver-Burk grafikas, kuriame pavaizduotas pradinio reakcijos greičio atvirkštinis ryšys su ABTS koncentracija. ABTS oksidacijos reakcija su skirtingomis lakazės koncentracijomis (0,025–3,0 mM) buvo matuojama esant pH 4,5, siekiant nustatyti kinetinius parametrus (Vmax ir Km). Michaelis-Menten kinetinės konstantos buvo apskaičiuotos naudojant Lineweaver-Burk grafiką, kuriame pavaizduotas reakcijos greičio atvirkštinis ryšys su substrato koncentracija. Kinetinės konstantos buvo apskaičiuotos iš Lineweaver-Burk grafiko naudojant „GraphPad Prism 6.01“ programinę įrangą.
Tradiciniai skaidrinimo fermentai, tokie kaip pektinazės, hidrolizuoja pektinines medžiagas, mažindami klampumą ir drumstumą. Jie efektyviai skaido struktūrinius polisacharidus ir dažnai naudojami kartu su kitais fermentais, tokiais kaip celiulazės ir hemiceliulazės, siekiant pagerinti išeigą ir skaidrumą. Tačiau pektinazės nėra specialiai nukreiptos į fenolio junginius, kurie yra pagrindiniai drumstumo ir oksidacinio rudėjimo veiksniai, ypač sultyse, tokiose kaip obuolių ir vynuogių sultys.⁵⁸Priešingai, lakazės katalizuoja fenolinių junginių oksidaciją, polimerizuodamos juos į didesnes, netirpias molekules, kurias galima pašalinti nusodinant arba filtruojant. Šis mechanizmas ne tik pagerina skaidrumą, bet ir pailgina sulčių galiojimo laiką, sumažindamas fenolinių junginių sukelto oksidacinio parudavimo tikimybę. Be to, lakazės pagrindu vykstantys skaidrinimo procesai gali būti atliekami švelniomis apdorojimo sąlygomis (pH 3,5–5,5, temperatūra 25–40 °C), todėl jie tinka subtilioms sultims gaminti nepakenkiant jų maistinėms ar organoleptinėms savybėms.⁵⁹Tyrimai parodė, kad apdorojimas pektinaze gali nuskaidrinti sultis per 1–2 valandas, o apdorojant lakaze paprastai reikia ilgesnio reakcijos laiko (3–6 valandos), kad būtų visiškai redukuoti fenoliniai junginiai. Tačiau šį procesą galima optimizuoti imobilizuojant fermentą arba derinant lakazę su mechaniniais skaidrinimo metodais.⁶⁰Šiame tyrime neapdoroto ekstrakto fermentinis profiliavimas atskleidė reikšmingą lakazės ir α-amilazės aktyvumą, tuo tarpu pektinazės ir ksilanazės aktyvumas buvo itin mažas, o celiulazės aktyvumo neaptikta. Todėl drumstumo ir fenolių kiekio sumažėjimą daugiausia lėmė lakazės veikimas, o klampumo pokytį iš dalies galėjo lemti amilazės veikimas.
1 lentelėje pateikti šviežiai spaustų obuolių sulčių ir lakaze apdorotų mėginių fizikocheminiai parametrai. Rezultatai parodė, kad šviežiai spaustų obuolių sulčių išeiga (71,59 %) buvo mažesnė nei lakaze apdorotų mėginių (87,34 %). Šie rezultatai atitinka Pilniko ir Orange'o išvadas.⁶¹, kurie nurodė, kad fermentų naudojimas vaisių perdirbime gali padidinti sulčių išeigą, pagerinti filtravimą ir gauti aukštos kokybės, skaidrias sultis koncentravimui. Sulčių išeigos padidėjimas daugiausia susijęs su tirpių cukrų kiekio padidėjimu sultyse. Vaisių fermentinės hidrolizės metu produkto ląstelių sienelėse esanti mezoglija ir pektinas yra sunaikinami ir paverčiami tirpiomis medžiagomis, tokiomis kaip neutralūs cukrūs ir rūgštys.^62.Fermentais apdorotų obuolių sulčių pH vertė buvo žymiai mažesnė nei kontrolinės grupės (P < 0,05), o abiejų grupių pH vertė laikymo metu reikšmingai padidėjo (1 lentelė). Šie rezultatai atitinka Mark ir kt. rezultatus.⁶³, kurie pažymėjo, kad anakardžių vaisių sulčių pH sumažėjo po laikymo po terminio apdorojimo. Pektino skaidymasis ir galakturono rūgšties susidarymas po apdorojimo fermentais gali būti atsakingi už pH padidėjimą laikymo metu. Fermentais apdorotų mėginių pH viso laikymo metu išliko nuo 4,05 iki 4,31, o neapdorotų obuolių sulčių pH svyravo nuo 4,12 iki 4,33.
Bendras rūgštingumas (BR) tiek neapdorotuose, tiek lakaze apdorotuose mėginiuose mažėjo ilgėjant laikymo laikui (1 lentelė). Rūgštingumo sumažėjimas buvo siejamas su organinių rūgščių virsmu angliavandeniais arba fermentinėmis reakcijomis, taip pat su oksidacija sulčių laikymo metu.⁶⁴Kontrolinių obuolių sulčių ir fermentais apdorotų mėginių bendras rūgštingumas buvo mažesnis nei kitų sulčių (braškių sulčių 0,9 %, slyvų sulčių 2,2 %, kumkvato sulčių 1,0 %, abrikosų sulčių 2,4 %, apelsinų sulčių 0,8 %), bet panašus į kitų sulčių (pvz., kriaušių sulčių 0,3 %).⁶²Šie neapdorotų šviežiai spaustų obuolių sulčių skirtumai gali būti dėl įvairių veiksnių, tokių kaip auginimo sąlygos, genetiniai veiksniai, brandos lygis ir perdirbimo metodai.⁶⁵Kontrolinės ir lakaze apdorotų obuolių sulčių bendro rūgštingumo sumažėjimas atitinka Singh ir kt. pateiktus rezultatus.⁶⁶dėl bendro „Jin Nuo“ obuolių sulčių rūgštingumo sumažėjimo po 74 dienų laikymo. Kita vertus, Oshmiansky ir Wojdylo⁶⁷tiriant tradicinių skaidrinimo metodų poveikį, reikšmingų obuolių sulčių rūgštingumo pokyčių nerado.
1 lentelėje pateikti rezultatai rodo, kad lakaze apdorotų obuolių sulčių bendroji tirpių sausųjų medžiagų (TSS) vertė buvo didesnė nei neapdoroto mėginio. Šie rezultatai atitinka paskelbtus tyrimus.^{. 68}Be to, 1 lentelėje parodyta, kad kontrolinės obuolių sulčių grupės TSS vertė pradiniame laiko momente buvo 9,58, o laikymo laikotarpio pabaigoje pasiekė 11,05. Šios vertės yra mažesnės nei Hamid ir kt. nurodytos šviežių obuolių sulčių TSS vertės.^{. 69}(Atitinkamai 11,2 ir 11,80). Lakaze apdorotų obuolių sulčių mėginių TSS vertė reikšmingai padidėjo – nuo ​​11,23 iki 12,93 po dviejų savaičių laikymo 4 °C temperatūroje (1 lentelė). Panašus TSS padidėjimas laikymo metu pastebėtas ir citrusiniuose vaisiuose, citrinose bei saldžiuosiuose apelsinuose. Bendro tirpių sausųjų medžiagų (TSS) kiekio padidėjimas laikymo metu gali būti dėl polisacharidų (krakmolo) hidrolizės į monosacharidus (cukrų), koncentracijos padidėjimo dėl sulčių dehidratacijos ir pektino skaidymosi sultyse iki tirpių sausųjų medžiagų. Bendro tirpių sausųjų medžiagų (TSS) padidėjimas greičiausiai susijęs su tirpių cukrų kiekio padidėjimu, kuris gali susidaryti atitinkamai pektinui arba celiuliozei paverčiant pektiną arba celiuliozę į tirpius cukrus, arba dėl krakmolo hidrolizės į cukrus, kaip pranešė Hamed ir kt.^69.Lakazės poveikį obuolių sulčių savybėms galima stebėti vizualiai, nes lakaze apdorotos obuolių sultys pasižymi geresniu tekėjimu ir mažesniu klampumu nei neapdorotos sultys. Šis stebėjimas pateiktas 1 lentelėje; fermentu apdoroto mėginio klampumas buvo 1,87 cP, o kontrolinio mėginio klampumas – 2,95 cP. Šis reikšmingas klampumo sumažėjimas greičiausiai susijęs su didesniu pektino tipo medžiagų vandens sulaikymo pajėgumu ir rišlios tinklinės struktūros susidarymu.
Šiame tyrime lakazės poveikis obuolių sulčių rudėjimo indeksui (BI) buvo tiriamas matuojant absorbciją esant 420 nm bangos ilgiui spektrofotometru. Rezultatai pateikti 1 lentelėje. Laikymo metu obuolių sulčių mėginių BI tiek apdorotose, tiek neapdorotose grupėse parodė laipsniško didėjimo tendenciją. BI atspindi rudėjimo laipsnį ir gali būti naudojamas kaip...^svarbusfermentinių ir nefermentinių rudėjimo reakcijų indikatorius. Absorbcija laikymo metu reikšmingai padidėjo (P < 0,05). Laikymo pabaigoje_A420Obuolių sulčių mėginių maistinė vertė kontrolinėje ir fermentais apdorotose grupėse padidėjo atitinkamai apie 217 % ir 121 % (1 lentelė). Rezultatai rodo, kad fermentų apdorojimas gali veiksmingai sumažinti rudumo laipsnį apie 56 %. Bezerra ir kt. rezultatai.^[19]] atitinka mūsų rezultatus; Jie naudojo lakazę-glutaraldehidą-kokosų skaidulas obuolių sultims skaidrinti, sumažindami jų pradinę spalvą 61 %.
Nors vaisių sultyse esantys polifenoliai turi teigiamą maistinį ir terapinį poveikį žmogaus organizmui, jie taip pat gali reaguoti su baltymais, sukeldami sulčių drumstumą, nuosėdų susidarymą ar drumstumą, taip pakeisdami produkto skonį ir aromatą bei sutrumpindami jo galiojimo laiką.⁷¹Šio tyrimo tikslas buvo saugiai sumažinti fenolinių junginių kiekį obuolių sultyse naudojant lakazę iš Pleurotus ostreatus NRC 620. 1 lentelėje pateikti rezultatai rodo, kad bendras fenolinių junginių kiekis lakaze apdorotose obuolių sultyse buvo reikšmingai sumažintas prieš laikant 4 °C temperatūroje. Be to, bendras fenolinių junginių kiekis taip pat sumažėjo laikant abiejuose tirtuose mėginiuose (1 lentelė). Sandri ir kt. tyrimas.⁷²parodė, kad fermentais apdorotos obuolių sultys gali išlaikyti savo antioksidacinį aktyvumą ir fenolio junginių kiekį. Tačiau Lettera ir kt. tyrimo rezultatai.⁷³rodo, kad apelsinų sulčių apdorojimas grybeline lakaze gali sumažinti fenolio junginių kiekį jose iki 45 %.
Fenoliniai junginiai pasižymi tokiomis savybėmis kaip laisvųjų radikalų gaudymas, singletinio deguonies redukcija ir gesinimas, vandenilio atomo perdavimas ir elektronų donorystė laisviesiems radikalams, todėl jie yra stiprūs antioksidantai.⁷⁴Todėl šiame tyrime DPPH ir FRAP metodais buvo įvertintas lakazės poveikis obuolių sulčių, laikomų šaldytuve 14 dienų, antioksidaciniam aktyvumui (2 lentelė). Abu metodai parodė padidėjusį antioksidacinį aktyvumą laikymo metu, kuris gali būti susijęs su laisvųjų fenolio junginių padidėjimu arba Maillardo reakcijos produktų (MRP) susidarymu, o Maillardo reakcijos produktai greičiausiai yra padidėjusio antioksidacinio aktyvumo priežastis.⁷⁵Nefermentinės rudėjimo reakcijos (įskaitant askorbo rūgšties skaidymą, Maillardo reakcijas ir rūgščių katalizuojamą cukrų skaidymą) gamina rudus pigmentus (melanoidinus). Tarpiniai askorbo rūgšties skaidymo produktai ir cukraus skaidymo produktai (pvz., karbonilo junginiai) gali reaguoti su aminorūgštimis per Maillardo reakcijas.⁷⁶Nors vaisių ir daržovių rudėjimas laikymo metu buvo plačiai ištirtas, mūsų supratimas apie šias reakcijas tebėra ribotas.⁷⁷Palyginti su FRAP metodu, lakaze apdorotos obuolių sultys, nustatytos DPPH metodu, parodė žymiai mažesnį antioksidacinį aktyvumą (2 lentelė), o visų mėginių antioksidacinis aktyvumas reikšmingai didėjo ilgėjant laikymo laikui. Šiame tyrime buvo naudoti du skirtingi antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai, nes jų principai skiriasi. DPPH metodas matuoja gebėjimą neutralizuoti laisvuosius radikalus, o FRAP metodas – gebėjimą redukuoti geležies jonus. Todėl, norint geriau suprasti tiriamų mėginių antioksidacinį aktyvumą, rekomenduojama naudoti kelis antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodus.⁷⁸
Vienas iš pagrindinių šio tyrimo išvadų yra tas, kad *Pleurotus ostreatus* lakazė NRC 620 pasižymi optimaliu aktyvumu esant 70 °C temperatūrai ir pH 3,0. Palyginti su kitomis grybų lakazėmis, dažniausiai naudojamomis sultims skaidrinti, tokiomis kaip *Trametes versicolor* ir *Ganoderma lucidum* lakazės, *P. ostreatus* NRC 620 pasižymi didesniu terminiu stabilumu ir rūgštesniu pH. *Trametes versicolor* ir *Ganoderma lucidum* lakazės paprastai pasižymi optimaliu aktyvumu 50–60 °C temperatūroje ir pH vertėse nuo 3,5 iki 5,0. Šis skirtumas gali prisidėti prie geresnio sulčių skaidrinimo efektyvumo, ypač rūgštinėms sultims, kur stabilumas esant žemesnėms pH vertėms yra labai svarbus. Unikali *P. ostreatus* savybė. Palyginti su kitomis tirtomis grybų lakazėmis, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 pasižymi gebėjimu efektyviai veikti sudėtingesnėmis sąlygomis. Aukštesnė optimali aktyvumo temperatūra rodo galimus pranašumus pramoniniame pritaikyme, tokius kaip greitesnis reakcijos greitis ir mažesnė mikrobų tarša. Žemas pH, kuris puikiai tinka daugelio sulčių rūgštinei savybei, gali būti naudingas sulčių skaidrinimo procesuose. Šie rezultatai pateisina tolesnius didelio masto taikymo tyrimus, todėl *Pleurotus ostreatus* NRC 620 yra perspektyvi alternatyva tradiciniams grybelinėms lakazės šaltiniams. Palyginti su ankstesniais tyrimais, nustatėme, kad optimali temperatūra yra 60 °C, o optimalus pH yra 3,0. Po 80 minučių trukmės reakcijos 60 °C temperatūroje *Ganoderma lucidum* lakazė išliko⁴⁶% jos veiklos.79 Pasak Kurniawati ir Nicelle⁸⁰*Ganoderma lucidum* fermentai pasižymi puikiu arba vidutiniu stabilumu esant 25 °C temperatūrai ir pH vertėms nuo 5,0 iki 8,0, bei stabilumu esant 6,0 pH ir 10–30 °C temperatūrai. Šiame tyrime nustatėme, kad optimalus pH ir temperatūra fermento aktyvumui *Pleurotus ostreatus* buvo atitinkamai 3,0 ir 70 °C. Po dviejų valandų inkubacijos 40 °C ir 50 °C temperatūroje fermentas išlaikė atitinkamai 68,33 % ir 59,61 % savo aktyvumo. Be to, Pleurotus ostreatus NRC 620 lakazė pasižymėjo dideliu aktyvumu plačiame temperatūrų diapazone nuo 50 °C iki 80 °C, beveik pasiekdama maksimalų aktyvumą (69–98 %), o maksimalus aktyvumas stebėtas 70 °C temperatūroje.
Apibendrinant, austrių grybų lakazė NRC620, gauta statinėmis sąlygomis, pasižymėjo optimaliu aktyvumu ir stabilumu esant įvairiam pH ir temperatūros diapazonui, t. y. geresniu stabilumu, palyginti su kitais fermentų šaltiniais. 10 mM MgSO₄ ir CuSO₄ pridėjimas padidino fermentų aktyvumą atitinkamai maždaug 21 % ir 35 %. Perdirbtas į obuolių sultis, fermentas sumažino pH ir klampumą, o fenolių kiekis laikant sumažėjo tik nežymiai.
Rezultatai patvirtina lakazės potencialą maisto pramonėje, ypač gėrimų skaidrinime. Specialiai skaidydama fenolio junginius, lakazė ne tik sumažina drumstumą ir pagerina skaidrumą, bet ir palaiko vaisių sulčių kokybę esant švelnioms darbo sąlygoms. Skirtingai nuo tradicinių skaidrinančių medžiagų, tokių kaip želatina, bentonitas ir silikagelis, lakazė nesukuria atliekų ir nepašalina malonių aromatų iš gėrimų, todėl yra ekologiškesnis ir tvaresnis pasirinkimas. Be to, palyginti su kitais fermentais ir filtravimo metodais, lakazė siūlo tikslinį ir ekonomišką sprendimą, nepakenkiant produkto kokybei.
Kyomuhimbo, HD ir Brink, HG. Vario turinčių lakazių taikymas ir imobilizavimo strategijos; apžvalga. Heliyon 9, e13156 (2023).